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心肌缺血再灌注损伤（MIRI）是急性心肌梗死（AMI）患者经皮冠状动脉介入治疗（PCI）或溶栓治疗后，心肌细胞功能恶化的关键病理过程。建立稳定的IRI动物模型是研究MIRI机制、探索保护策略的核心工具。以下是大鼠、小鼠、巴马小型猪三种常用模型的构建方法及验证要点：
大鼠：首选SD或Wistar大鼠（雄性，68周龄，220-250g），因冠状动脉侧支循环少、操作难度低、成本低，是国内外公认的经典模型。
小鼠：常用C57BL/6J或BALB/C小鼠（雄性，6-8周龄，22g±2g），遗传背景明确、操作可控，适合基因功能研究。
巴马小型猪：心脏解剖与生理特征与人类高度相似，适合模拟PCI术后再灌注损伤，模型稳定性高、存活率高（100%）。
麻醉与固定：用1%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术板，连接心电监护仪。
开胸与暴露心脏：胸骨左侧剃毛、消毒，沿第3-4肋间做4cm纵切口，钝性分离皮下肌肉及胸膜，用止血钳撑开肋骨，暴露心脏。
结扎冠状动脉：用6-0带针缝合线结扎左前降支（LAD），位置为左心耳下1-2mm（与左心耳尖平行），进针深度约1mm，宽度1-2mm（避免穿透心室壁）。结扎线cm于胸腔外（用于再通）。
缺血与再灌注：结扎后观察5min，确认心电图ST段抬高（缺血成功标志）；缺血30分钟后，缓慢拉出结扎线，恢复血流（再灌注成功标志：ST段下降50%或T波下降，心律失常逐渐消失）。
术后处理：无出血后用3-0缝合线逐层缝合胸腔，消毒切口，放回笼内保温复苏。
麻醉与固定：用戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射或（2%）吸入麻醉，仰卧固定于解剖板，安装心电监护仪。
开胸与暴露心脏：胸骨左侧第3-4肋间做1cm纵切口，钝性分离肌肉及胸膜，快速挤出心脏（避免损伤肺）。
结扎冠状动脉：找到冠状动脉左前降支后，以7-0无损伤缝针距离左心耳下缘的2mm左右穿过心肌表层，并在肺动脉圆锥旁出针，待稳定15min后，在心脏表面结扎处放一长约2mm的聚乙烯管，作活结进行结扎。
缺血与再灌注：结扎后观察5min，确认ST段抬高（缺血成功）；缺血30分钟后，缓慢拉出线头，恢复血流（再灌注成功标志同大鼠）。
术后处理：挤出胸腔内气体（防止气胸），用3-0缝合线逐层缝合切口，消毒后放回笼内。
麻醉与固定：用3%戊巴比妥钠（2030mg/kg）耳缘静脉麻醉，仰卧固定于手术台，连接心电监护仪及血压监测。
开胸与暴露心脏：胸骨正中切口，分离皮下组织及胸骨，撑开肋骨，暴露左前降支（LAD）第一对角支起始点。
预封堵与结扎：预封堵LAD 5min（模拟短暂缺血），解开后2min再次原位结扎LAD，造成缺血60min；60min后解除结扎，恢复血流。
再灌注成功：ST段下降50%或T波下降，心律失常（如室速、室颤）逐渐消失，心率趋于平稳。
TTCEvans blue双染：梗死心肌呈白色（TTC不染色），危险区呈红色（Evans blue不染色、TTC染色），远端区呈蓝色（两者均染色）。
HE染色：梗死区心肌细胞变性坏死（肌纤维断裂、核固缩），伴大量炎性细胞浸润。
Masson染色：术后28d可见心肌梗死区域纤维瘢痕形成（胶原纤维呈蓝色）。
术后6h/24h血清心肌酶谱升高：肌酸激酶同工酶（CKMB）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌钙蛋白（cTnT）明显高于术前（P0.01）。
术后左室射血分数（EF%）、左室缩短率（FS%）降低，左心室舒张末期内径（LVDd）、收缩末期内径（LVDs）升高（提示心功能受损）。
本期推荐的是由中国中医科学院中药研究所、山东中医药大学药学院、兰州大学药学院、中国中医科学院中药资源中心道地药材国家重点实验室等研究团队合作，于2025年5月29日发表在中科院一区TOP期刊Phytomedicine(IF 8.3)的一篇文章，阐明了羟基红花黄色素A治疗MIRI的作用机制和直接靶点。
羟基红花黄色素A通过促进MDH1介导的线粒体代谢稳态改善心肌缺血/再灌注损伤
心肌缺血/再灌注损伤（MIRI）是急性心肌梗死治疗中的关键并发症，极度影响临床预后。羟基红花黄色素A（HSYA）是从红花中提取的天然化合物，已被国家药品监督管理局批准用于心脑血管疾病的治疗。尽管经验证据支持其对MIRI的治疗效果，但其潜在机制尚未完全阐明。
通过雄性C57BL/6小鼠的左前降支结扎MIRI模型和缺氧/复氧（H/R）损伤的H9c2细胞模型进行药理学评估。采用还原性二甲基标记结合串联正交蛋白水解-活性蛋白质分析（rdTOP-ABPP）和液相色谱-串联质谱联用技术，研究作用机制并鉴定直接靶点和结合位点。进行基因本体论和京都基因与基因组百科全书富集分析，以阐明HSYA的治疗机制。使用细胞热位移实验检测药物-靶蛋白结合效率。系统地进行酶活性分析，评估HSYA如何调节核心代谢酶。此外，通过小干扰RNA转染建立候选分子靶点与其核心生物学功能之间的因果关系。
我们发现，在MIRI诱导的小鼠中，HSYA给药显著减少了心肌梗死面积，改善了心脏功能，抑制了细胞凋亡，并通过增加ATP产生和平衡NAD+/NADH水平恢复了心肌生物能量。在H/R损伤的H9c2细胞中，HSYA剂量依赖性地减少了线粒体损伤，降低了活性氧的产生，抑制了线粒体通透性转换孔的开放，并促进了线粒体能量代谢，包括糖酵解和氧化磷酸化水平。基于半胱氨酸（Cys）的活性蛋白质分析显示，苹果酸脱氢酶1（MDH1）——一种参与维持线粒体能量代谢稳态的关键代谢酶——被确定为HSYA的核心靶点。HSYA通过Cys残基137共价激活MDH1，从而促进MDH1的生物能量酶活性并恢复线粒体能量代谢稳态。重要的是，破坏MDH1或预测的结合位点显著消除了HSYA的心脏保护作用。
1、HSYA对C57BL/6小鼠心肌缺血再灌注损伤（MIRI）具有保护作用。各组心脏经TTC/伊文思蓝染色后的代表性照片如图A所示。实验组(B)和对照组(C)在MIRI后24小时的胰岛素敏感性（IS）和糖耐量异常反应（AAR）指标均进行了定量分析。通过超声心动图评估心脏功能，展示代表性图像(D)、射血分数百分比(F)和射血分数指数（FS）(G)、心率(E)。MIRI小鼠在再灌注24小时后，乳酸脱氢酶（LDH）(I)和超氧化物歧化酶（SOD）(H)水平升高。心脏TUNEL染色图像及定量分析结果如图J所示。ATP (K)和NAD+/NADH (L)水平增加，磷酸化AMPK表达量也明显提升(M)。“meto”代表阳性药物美托洛尔。
2、HSYA改善了H/R损伤的H9c2细胞线粒体代谢稳态。评估了HSYA给药（50、100和200 µM）对H9c2细胞的细胞毒性效应（A）。HSYA减轻了H/R诱导的细胞活力下降（B）和ROS生成（C、F，放大倍数：20×）。通过JC-1染色测定，HSYA增加了H/R诱导的H9c2细胞线粒体去极化（D、G，放大倍数：20×）。HSYA还抑制了mPTP的开放（E、H，放大倍数：20×）。HSYA处理明显提高了线粒体呼吸能力，表现为ATP含量、最大呼吸和备用呼吸容量的增加（I、J）。HSYA促进了糖酵解，表现为糖酵解PER、代偿性糖酵解以及糖酵解储备的增强（K、L）。HSYA处理还激活了磷酸化AMPK（M）。
3、鉴定MDH1为HSYA在MIRI中的直接靶点。HSYA与IA炔烃探针竞争性结合半胱氨酸残基(A)。基于rdTOP-ABPP技术的靶蛋白捕获示意图(B)。HSYA在心脏或H9c2细胞裂解液中呈现剂量依赖性标记靶蛋白(C)或H9c2细胞裂解液(D)。信号通路分析(F)和生物过程研究(G)表明“三羧酸循环”是显著信号通路。在H9c2细胞中，HSYA处理后，三羧酸循环中的10种酶(E)的7个基因（包括MDH1、Mdh2、Sdha、Suca、Ogdh、Odo1和Ldha）均没办法恢复细胞活力(H)。通过CETSA检验测试发现，HSYA可促进MDH1的热稳定化(I)。HYSA还增强了MDH1的催化活性(J)。
4、MDH1在HSYA介导的心肌细胞对心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的保护机制中起关键作用。实验多个方面数据显示：经MDH1 siRNA处理后，HSYA既未能提升细胞活力(A)，也未能逆转缺血/复张期诱导的
-活性氧（ROS）生成（B、E，放大倍数：20×），更没办法恢复线粒体膜电位（MMP）的衰减（C、F，放大倍数：20×）以及线粒体通透性转换蛋白（mPTP）的异常开放（D、G，放大倍数：20
×）。此外，HSYA还完全丧失了改善氧化磷酸化(H)和糖酵解(I)的功能。
5、WEE抑制了大鼠肾脏中由IR诱导的细胞凋亡和铁死亡。HSYA直接与MDH1的Cys137残基结合。通过LC-MS/MS分析(A)，鉴定出MDH1的Cys137残基是HSYA的潜在结合位点。分子对接分析揭示了HSYA与MDH1之间的结合相互作用（B、C）。通过CCK8检验测试发现，MDH1的Cys137突变消除了HSYA治疗的心脏保护效应(D)。
总之，HSYA可通过直接靶向MDH1激活能量代谢从而发挥心脏保护作用，是一种极具前景的MIRI治疗策略。本研究基于rdTOP-ABPP方法明确了HSYA发挥治疗性心脏保护效应的直接分子靶点（MDH1），这是HSYA调控MIRI研究中的关键进展。这些根据结果得出HSYA是代谢和线粒体稳态的潜在守护者，在治疗能量代谢相关疾病方面具有广阔应用前景。作为典型代谢靶点的MDH1，对代谢紊乱疾病具备极其重大治疗潜力。在更深层次上，我们的工作不仅为HSYA的临床应用提供了科学依据，还为通过激活MDH1来鉴定治疗MIRI的独特心血管保护剂提供了指导方向。
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